实验室生物安全

一、人类历史上的重大疾病

公元前430年的雅典发生了鼠疫疫情，鼠疫也称黑死病、腺鼠疫、腹股沟淋巴结鼠疫，是由鼠疫耶尔森氏鼠疫杆菌引起的甲类传染病。到14世纪，欧洲大陆发生鼠疫大流行，1/4人口（约2500万）病死。霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道甲类传染病。汉朝前就有记载，全世界共有7次大流行。其中1817年到1923年间的6次大流行，仅印度死者就超过3800万。公元前412年的古希腊时期至今，共发生了31次流感大流行，其中1918年至1920年的“西班牙流感”，在全球范围内造成了2000万～4000万人死亡。

除此之外，天花病、麻风病、艾滋病、炭疽病、各型肝炎和SARS等传染病也给世界许多国家的社会、经济和人员造成巨大的灾难和损失。因此世界各国和各个世界卫生组织均在开展实验室研究，探寻控制传染病的方法。

二、实验室历史上的感染事件

在实验室开展高致病性病原微生物的研究，就有可能发生职业暴露而导致实验室感染。1886年科霍第一次报告了一例霍乱病的实验室感染事件。受害者是德国柏林的一名员工，他在处理霍乱弧菌培养物时遭到感染，并得了霍乱病。有关实验室感染的统计报告，最早见于1951年美国医学杂志上，列出美国实验室感染的1342个病例，感染涉及69种不同的微生物。值得注意的是其中1275例是在1930年以前发生的，那时很多人不注意生物安全的问题。

1979年4月，前苏联斯维尔德洛夫斯克生物武器实验室发生泄露事故，约10公斤的炭疽芽孢粉剂泄漏，爆炸释放出大量的毒雾，造成附近1000多人发病，数百人死亡。这是典型的事例。最常见的实验室感染见于乙肝病毒，第一例肝炎的实验室感染报告是在1931年由芬德利报道的，客观上有大量的乙肝病毒实验室感染事实存在。根据我国北京第二传染病医院孙孚报告（1987），在该医院246名职工调查中，发现乙型肝炎病毒感染者141人，而检验科职工的感染例数，在18个不同科室中占第5位。 还有可怕的人类免疫缺陷病毒（HIV），1993年12月美国CDC报告了17名实验室技术人员因职业而发生的HIV感染，而且有15名可能是在美国发生的。经皮穿刺接触是导致传染的原因。

近期则有3起由SARS冠状病毒引起的实验室感染事件。2003年12月5日台湾国防部医学院预防研究所一位中校,在本所BSL-4实验室被感染;2004年9月8日，新加坡国立大学微生物实验室的一名博士后研究生,在环境卫生研究院实验室被感染；2004年4月27日北京一个国家级病毒病研究机构，一名安徽大学研究生被感染。

三、实验室感染的危害性

北京SARS冠状病毒引起的实验室感染事件出现了第三代感染，9人致病1人死亡，造成了极大的负面影响，引起了国家高度重视。在2004年7月8日的卫生部电视电话会议上，高强副部长通报了这起事件的处理决定，认为是一个应该避免而没有避免的重大责任事件，以当时的管理状态发生事故是必然的过程。从此启动了我国的实验室生物安全管理体系建设工作。在实验室管理中人们通常只关注检测质量的管理，忽视安全、特别是生物安全的管理。这是因为人们普遍认为实验室不太可能发生感染，即使感染也没有很严重的后果。这种观点是错误的，虽然从事高致病性病原微生物研究的实验室不多，但实验室感染是客观存在的现象。直接和致病性或高致病性病原微生物打交道，本身就存在风险。如伤寒是实验室感染中比较严重的肠道传染病，第一次报道在1893年，到1978年共报告了258例，其中20例死亡。1951年报告了153例肺结核感染，其中有25例与实验室工作有关。由细菌引起的实验室感染尚有多种疾病，如白喉、痢疾、霍乱、鼠疫、炭疽和流脑等。1976年报告的3921例实验室感染中，细菌及螺旋体感染占1669例。有些是新发现的病原微生物，一旦具有致病性由于人们缺乏防范意识将极具感染风险，如八十年代的艾滋病病毒。有些是我们熟悉的微生物，在原先的观念中对人无致病力或低致病力，现在受到环境的影响发生变异，演化为高致病性或致病性较强的病原，如人禽流感病毒、冠状病毒、猪链球菌等。

近年来我国和世界各地发生了多起影响较大的传染病疫情，如人高致病性禽流感、猪瘟和手足口病等。禽流感以前只在禽类中传播，如新疆地区2007年11月发生的高致病性禽流感疫情共扑杀各类家禽32.25万只（羽），现在变成了人高致病性禽流感，频繁使人类致病，中国卫生部追溯诊断2003年11月底的一个不明原因发热、肺炎病例为人感染高致病性禽流感(H5N1)确诊病例。这是中国大陆目前已知最早的经实验室确诊的人禽流感病例，也是在当前这一轮禽流感疫情中全球发现最早的人禽流感病例。根据世界卫生组织和中国关于人感染高致病性禽流感病例诊断标准的规定，自2005年11月16日以来，中国已通报25例人感染禽流感病例，其中13例死亡。据世界卫生组织统计，至今禽流感在全球已导致340多人感染，其中160多人死亡。猪瘟也是历史上常见的动物疾病，2005年6月发生在四川的猪链球菌疫情却发生人类感染，分布在资阳等32个县（市、区），还扩散到广东等地。累计感染人数达200多人，并造成惊人的38人死亡。手足口病由肠道病毒-71型(EV71)或柯萨奇病毒A16型(CoxAl6)）引起，是婴幼儿常见传染病，但山东临沂市4月发生疫情，致1260多人发病，3人死亡。还有许多报道都显示许多常见病原发生了明显的变异，产生新的致病能力。如果没有建立有效的管理体系，实验室感染等意外将不可避免。

四、实验室生物安全管理

北京实验室SARS冠状病毒感染事件调查结论：跨专业从事实验研究，腹泻病研究室研究呼吸道病原；研究人员未经专项培训，灭活方法未经论证，未建立健康监测制度；生物安全实验室选择不当，防护等级不足；生物安全柜等专用设备未启用，未按适当的程序和方法进行操作，操作人数不足；未执行实验室管理制度。

调查结论的核心问题就是规章制度。有无制订实验室生物安全管理的各项规定，规定是否合理、完善，规定是否被认真执行，规定在执行中是否被曲解，都直接影响到实验室生物安全管理的有效性。几年来，国务院颁发了第424号令《病原微生物实验室生物安全管理条例》和第380号令《医疗废物管理条例》，卫生部、环保总局、建设部、国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会等国家相关部门出台了《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》、《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》、《生物安全实验室建筑技术规范》、《实验室生物安全通用要求》等一系列文件和技术标准，为实验室生物安全管理体系建设打下了坚实的基础。法律法规和各项生物安全规定要落实到每个实验室，需要建立完善的管理体系。

实验室生物安全管理体系分为室间和室内两个管理体系。

室间为实验室生物安全行政管理架构，由省卫生厅牵头，联合省科技厅、省教育厅、省质检局、省农业厅等部门协同管理。建立成立省级专家队伍；编制全套生物安全管理法规文件；建立监督管理体系和检查评估体系；建立BSL-2实验室和BSL-3实验室管理模式。担负传染病防控任务的卫生部门是实验室生物安全管理的重点，各级卫生行政主管部门要建立实验室生物安全行政管理体系；实施实验室备案，开展各项实验活动，如检测活动、高致病性病原微生物菌（毒）种及样本的运输、科研项目生物安全审查、生物材料出入境审批等工作；组织基本面调查、监督和检查。

室内指实验室设立单位建立的实验室生物安全管理体系，从单位的层面全面开展涉及病原所有工作的管理。成立生物安全管理委员会、设立管理办公室，建立监督员、内审员队伍；制订生物安全管理体系文件；建设标准化的、适合工作需要的生物安全实验室；开展系统培训；实施各项管理活动；建立健康监测机制。各个实验室则负责配备、使用和管理相适应的生物安全设施、设备和物品；控制样品流转；做好实验室准入、特殊活动审批、个人防护、废弃物处置和应急等工作。

五、实验室生物安全相关概念

1.生物因子(bio-agents):具有一定生物活性的物质，或来源于活生物的物质,包括生物体本身。

2.微生物（microbes, microorganisms）:微生物是指活的生物因子，包括能够复制或基因物质传递的细胞或非细胞的微小生物实体，其中包括致病和非致病的微生物。主要指细菌（螺旋体、立克次体、衣原体）、真菌、病毒和某些寄生虫。

3.病原体（pathogens）:病原体是能致病的生物因子，包括能够引发人和动物、植物传染病的生物因子，主要指致病微生物。按危害程度分为四类：

（1）一类病原微生物

高个体危害，高群体危害临床表现起病迅速，病程短，病情严重，病死率高，通常导致个体死亡，或者痊愈之后有严重的后遗症。这类疾病可能传播的途径多，传播速度快，动物与人之间的传播十分普遍，或者人与人之间的传播，人群普遍易感。这类病原体的实验室操作应该在BSL－3级或者以上级别的实验室进行。

（2）二类病原微生物

高个体危害，低群体危害临床表现起病迅速，病程短，病情严重，病死率高，通常导致个体死亡，或者痊愈之后有严重的后遗症。这类疾病传播速度比第一类要慢，动物与人之间的传播比较普遍，也存在人与人之间的传播，人群普遍易感。但是流行的范围没有第一类广泛，病死率可能比第一类要低。这类病原体的实验室操作应该在BSL－3级进行。

（3）三类病原微生物

中等个体危害，有限群体危害临床表现起病较快或者潜伏期比较长，起病之后病情不严重，病死率低，一般不导致个体死亡。这类疾病可能传播的途径多，传播速度慢，存在人与人之间的传播，仅仅在局部流行，有药物可以使用。这类病原体的实验室操作应该在BSL－2实验室进行。

（4）四类病原微生物

低个体危害，低群体危害一般情况下，这类病原体不会引起个体和群体的感染，个体感染后可能出现临床症状，也可能出现隐性感染没有任何临床症状。起病后症状较轻，有治疗的药物使用，经过治疗后可以痊愈，一般不会留下后遗症。这类疾病可能传播的途径有限，人群普遍具有抵抗力。这类病原体的实验室操作在BSL－1级实验室进行。

4.生物危害(bio-hazard)和生物危险(bio-risk)：生物危害是由生物因子形成的伤害；生物危险(bio-risk)是生物因子将要或可能形成的危害，是伤害概率和严重性的综合。

5.危险废物（hazardous waste）：即有潜在危险的废物，即可燃、易燃、腐蚀、有毒、传染、放射或其他破坏作用的废物

6．生物威胁(bio-threat)：是指生物因子形成的使人忧虑的、可能发生的严重危害。

7.生物气溶胶(bio-aerosol)：气溶胶是指悬浮于气体介质中粒径一般为0.001-100μm的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。在分散相中含有生物因子的气溶胶。8.生物战剂(agent of bio-war,):战场上使用含有病原体的物质。

9.生物战剂气溶胶(bio-agent aerosol)：分散相含有生物战剂的气溶胶。气溶胶喷洒是国外生物战释放生物战剂的主要方式。

10．生物战（bio-war）：是指用生物战剂进行的战争。目前世界发达国家的生物武器相当先进，武器化能力很强；一些第三世界国家也掌握了生物武器，被称为穷人的原子弹；一旦使用，造成的灾难不可设想。国内外有关专家认为发生生物战的潜在危机正在增加，令人忧虑。

11．基因武器（gene weapon）：指用基因工程研制的生物武器。 现代生物技术的发展一方面为人类造福，另一方面也会被人利用发展武器。现代生物技术能改变生物战剂的攻击性能，改变其抗原性使之难以诊断；增强其致病性以加强杀伤力；增强其存活力以延迟攻击时间和扩大攻击面积；增强其抗药性造成治疗困难；改变其基因特性形成基因武器。专家推测，基因武器能够进行对人种的特异性攻击。

12．实验室相关感染(laboratory-associated infection)：由于从事实验活动而发生的与操作的生物因子相关的感染。在研究病原微生物中存在某种风险，如果在管理和操作病原体中一旦有所疏漏或错误就会发生实验室感染，造成威胁，进而可能造成病原体扩散或传染病的流行。

13．医院感染(hospital-acquired infection)：医院感染也叫医院获得性感染或院内感染,指在医院内发生的一切感染。

14.人畜共患病(zoonosis):人和动物间相互传播的传染病。人的传染病常常由动物传播,可通过接触经皮肤和粘膜感染,也可经消化道进入体内,更可通过气溶胶经呼吸道感染。

15．外来病(exotic disease)：国外存在和流行的，国内尚未证实存在或已被消灭的传染病。

16．传染病（communicable disease）:是指由各病原体引起的一组具有传染性的疾病。已有的一些烈性传染病还没有有效的预防和控制，已经控制的一些传染病有死灰复燃的势头，新的传染病不断出现，是我们面临挑战 。

17．突发公共卫生事件(emergent events of health)：（简称突发事件），是指突然发生，造成或者可能造成社会公众健康严重损害的重大传染病疫情、群体性不明原因疾病、重大食物和职业中毒以及其他严重影响公众健康的事件。突发公共卫生事件的危害性和破坏性是多方面的，不仅危害公众身体健康和生命安全、造成公众心理恐惧，甚至导致社会混乱、经济衰退，威胁国家安全。

18．食源性传染病（food borne infectious）：指通过饮食媒介经消化道感染的疾病。2000年第53届世界卫生大会上，世界卫生组织将食品安全列为重要议题，并指出食源性疾病与食品污染是不断扩大的公共卫生问题。在过去的20年里，食源性疾病的发生率明显上升。在发达国家，估计每年有1/3以上的人群感染食源性疾病。美国每年约有7000万～8000万人患食源性疾病，其中32.5万人入院治疗，5000人死亡。

19.实验室生物安全:指为了避免各种有害生物因子造成的实验室生物危害而采取的防护措施（硬件）和管理措施（软件）。国家标准《实验室生物安全通用要求》对生物安全的定义是避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。

20.生物安全实验室：具备生物安全防护能力的实验室，分为4级。

六、生物安全防护

1.实验室生物安全防护的类型：

一级防护（隔离）(primary barriers)：包括两方面内容：

（1）生物安全柜(biological safety cabinet, BSC)和类似的设备等，生物安全柜是直接操作危险性微生物时所用的箱形安全设备，是生物安全实验室必备的装备，分成三个级别。一级生物安全柜没有正面遮挡保护，进生物安全柜的风速较低，不能保护样本，对实验人员和环境的保护能力有限；二级生物安全柜正面有超过2/3遮挡保护，进生物安全柜的风速较高，能够有效保护样本、实验人员和环境，按排气量的多少又分为4个型号，应根据工作类型选择匹配的型号；三级生物安全柜正面为全遮挡保护，进生物安全柜的风速较高，对样本、实验人员和环境均有非常可靠的保护。

（2）个人防护装备(personal protective equipment, PPE)，也分成三个级别。一般防护，工作服、手套即可；严格防护，使用专用防护服，尽量遮盖暴露皮肤、口鼻等部位；严密防护，遮盖所有暴露皮肤和面部器官，只要可能，尽量使用两层以上防护装备但不妨碍操作和行动。

脱卸个人防护装备的顺序是：外层手套→防护眼镜→防护服→口罩帽子→内层手套。

二级防护（屏障）(secondary barriers):是指实验室屏障设施，其建设有4种不同的结构标准。

2.实验室生物安全防护的等级：各种一级防护和二级防护的组合，加上合适的管理措施构成不同防护级别的生物安全实验室。

七、生物安全实验室建设和管理原则

坚持八项基本原则，即科学合理、安全首位、软件在先、管理严格、远离病原、预防为主、使用方便和厉行节约，传染性和致病性再强的病原微生物,只要它不和人体接触，感染就不会发生。隔离、过滤、消毒灭菌和采用个人方式措施均是有效生物安全防护手段。一定要按照国务院发布的《病原微生物实验室生物安全管理条例》进行管理，尽可能少接触病原体或少进实验室。在实验前对设施、设备进行常规检测，在实验过程中进行安全监测，在实验后对人员实施健康检测、对环境进行泄漏检测和消毒效果监测。

八、实验室生物安全管理体系

1.实验室生物安全管理体系：

建立方针和目标，并建立组织、程序、过程和资源实现既定的目标。确保每个生物医学检测和相关人员熟知生物安全知识，熟练掌握操作技能；确保防护设备和防护用品的供应；确保实验室工作人员不受实验对象侵染；确保周围环境不受致病微生物的污染；确保致病性病原微生物的样品或菌（毒）种不会遗失或被偷窃。为实现目标，必须设立专门的机构，制订完善的体系文件，按规定的要求做好各项防护措施，按既定的计划实施各项管理、监督和检查工作。

2．生物安全组织结构：

成立生物安全委员会、设立日常管理办公室、建立生物安全员队伍。规定实验室生物安全机构、管理组织和相关部门、相关成员的权力、义务和职责。规定领导部门、监管部门、执行部门、支持部门之间的关系。绘制组织结构框图。有可靠的代理机制和沟通机制。

3.生物危害性评估

生物安全操作的核心是危害评估。由实验室最熟悉所要操作的微生物的特性、所使用的实验和防护设备、实验程序和政策的技术人员进行。评估应充分、及时、准确。应公告、制度化并能适时更新。

4.生物安全体系文件

体系文件由实验室生物安全管理手册、程序文件、安全手册、生物危害性评估、SOP和表格等文件组成。管理手册是对本单位实验室生物安全管理总的原则性描述，包括生物安全所有要素。通常以国际标准ISO15189-2003为基础，结合我国生物安全相关法律法规的要求制订，适用于整个单位和领导层使用，是第一层次的文件。程序文件通常指各方面具体的规章制度，为管理手册的支持性文件，适用于单位内部各实验室、各部门使用，为第二层次的文件。SOP为标准操作规程，也称作业指导书，通常针对每项具体的活动、每个岗位、每台设备，由每个从事实验室活动的人员所使用，为第三层次的文件。表格为体系运行过程中技术和管理方面为记录而设立的文件，可为运行提供证据，是第四层次的文件。

体系文件可以三层或四层，依实际情况而定，程序文件可以并入管理手册或SOP。实验室生物安全管理体系文件形成后，应通过有效文件或在正式场合宣布生效，广泛宣贯并要求本单位生物安全相关部门、机构和个人必须遵守体系文件的各项规定。重要的文件、技术规范要编制发放清单，建立领取登记、借阅等制度，必要时还应进行遗失登记，保持文件的现行有效性。应将各类生物安全文件系统地收集、装订成册。

5．人员管理

应选派本单位实验室生物安全管理和检测人员到上级或相关部门参加专项培训、专业进修等，实时举办全员培训，让所有相关人员深刻理解国家有关实验室生物安全的法律法规、技术规范和行政规定，特别是本单位的实验室生物安全管理体系文件。建立每位工作人员的健康档案，及时针对工作对象采取相应的免疫或防护措施。

6.设备管理

设备管理的目的是保证设备的质量和运行中的可靠性。在采购时要追求质量，在安装时要保持性能，在使用前应制订操作SOP和维护计划，在使用时要规范操作。建立管理档案、使用标识、及时记录和适时验证。

BLS-2实验室安全设备一般包括:Ⅱ级生物安全柜;高压灭菌器;洗眼器。BSL-2实验室应设置洗手池，但不能装配手动式的水龙头；生物安全仪器设备在运行前必须进行经过合格检查并具有状态标识；实验室应具备一定的安全防护能力，必须配备闭门器；每个实验室应有洗手池，洗手池宜设置在靠近实验室内近门处；BSL-2实验室内使用过的防护服不得穿出实验室；按照《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）的要求，BSL-2实验室应有“洗眼器”装置；

7.样品流程控制

样品的整个流程从获得开始直至消除的全过程应有控制措施和记录（可以整批），每个流转环节必要时应审批。未知病原微生物按生物安全二级防护进行操作。在包装时应确保包装材料的牢固性、密闭性和安全性。在运输时要注意样本的质量和防护，如果怀疑是高致病性生物材料时还要申请审批。在交通工具、运输人员、包装方式等符合相关的规定。在传播、接收、保藏和处置样本时也应规范操作，特别是菌（毒）种管理要建立完善的管理制度，设立专门的保管人员、选择合适的场所、使用专用的保藏设备和采取适当的防护措施来保证菌（毒）种的安全。

8．生物安全二级实验室

生物安全二级实验室是涉及病原微生物操作的最低条件。当操作人体材料时，只要可能含有病原微生物，原则上都应在生物安全二级实验室中进行。实验室为普通建筑物即可，但尽量设计在人员走动较少的地方或走廊的盲端。布局应合理有序，人流、物流清晰，有足够的空间，清洁区和污染区有一定的区分，严禁实验区与办公区混杂，建立实验室准入门槛，张贴警示标志、安装自动闭门器，安装牢固的门窗。每个实验室应设洗手池，宜设置在进出口处。实验室光线充足不晃眼、宜自然通风，但窗户应使用纱窗。应设计控制昆虫和啮齿动物进入的屏障，保证下水道、门、窗及各种电器或设备管道的密闭性。

应做好个人防护，配置生物安全柜等防护设备和器械，要求实验室就近有压力蒸气灭菌器。有可靠的电力供应和应急照明，制订应急救治预案，装备应急救治物品，实验室的门设有可视窗，出口有发光指示标志，标明撤离路线，应配备适量的消防器材，设洗眼设施，必要时可安装应急喷淋装置，保证安全。

9．内务管理

实验室对人员的准入依照不同生物安全防护等级分别进行限制。与实验无关或妨碍实验的物品或设备不放置在实验室，实验室内的人员数量或无关人员的出入予以限制，一切与实验无关的行为或工作予以禁止。在实验时应卸掉各种妨碍操作和带来危险的佩戴物。无论是否戴手套，只要接触感染性材料或潜在的危险，应及时洗手，并使用感应等非手动的水龙头。废气、废物、废水应满足环保的要求，交由具备资质的专业机构处理。还要防止有害的生物体在灭活之前移出实验室。废弃物应分类存放，对锐器应有防护。可重复使用器械回收应灭菌、清洁，彻底去除污染病源微生物。